重要器官伤口的大出血通常会导致严重失血，全球30%以上的人口死于意外事故和手术中的大出血。特别是穿透伤致死性主动脉破裂和无法控制的心脏大出血是急诊抢救中的重要问题。出血控制非常具有时间敏感性，快速止血干预将决定受伤患者的生存。目前临床手术中最常用的闭合伤口止血手段是外科纱布、缝线和缝合钉。然而，对于心脏、肝脏、脾脏等脆弱易出血器官，使用这些方法止血容易造成二次损伤，甚至导致手术失败。

基于此，中国科学院化学研究所吴德成教授、中国人民解放军总医院唐佩福教授、张里程副教授和国家纳米中心Feifei Sun合作开发了一种共价交联的AG-PEG胶，基于细胞外基质样的氨基明胶(AG)和PEG衍生物。AG-PEG胶水快速成胶，并在给药后与各种潮湿组织表现出牢固和不分青红皂白的紧密粘附。形成的胶水形成了一种粘稠而坚固的屏障，密封动脉、肝脏和心脏的出血性伤口，使其能够承受高达380 mmHg的血压，而正常收缩压为60-180 mmHg。值得注意的是，在猪心脏直径为6 mm的穿通孔中，使用胶水可以在60秒内有效地阻止大量出血。术后各指标逐渐恢复，14 d时心脏创面明显再生。AG-PEG胶具有随需溶解度、自胶性和快速降解性，可能为临床止血和紧急抢救提供一种新颖的止血方法。相关工作以“A Super Tough, Rapidly Biodegradable Ultrafast Hemostatic Bioglue”发表在《 Advanced Materials》。

【文章要点】

图1. AG-PEG胶的原理图制作及力学强度研究

AG-PEG胶的合成及物理表征

以氨基明胶(AG)和四臂聚(乙二醇)琥珀酰亚胺琥珀酸盐为原料，制备了一种可控制溶解、快速成胶的生物胶，具有坚韧的机械强度、快速生物降解和黏附性能。明胶的氨基部分在接触后与PEG的琥珀酰亚胺活性酯快速反应，AG-PEG胶水在几秒钟内完全明胶化，从而有效地黏附和密封急性出血组织，快速止血(图1A)。此外，部分琥珀酰亚胺活性酯部分立即与蛋白质的氨基发生相互作用，从而在水凝胶和组织之间牢固地形成化学结合。氨基的引入增加了交联密度，从而允许AG与Tetra-PEG-SS混合，形成透明坚韧的水凝胶(原始明胶不能)。考察了前体溶液中不同浓度AG-PEG组分的AG-PEG胶的成胶时间。当浓度从5 wt%增加到30 wt%时，凝胶化时间从(80.1 ± 3.2)s减少到(37.0 ± 3.8)s，差异有统计学意义。这可能是由于前驱体溶液中交联点浓度过高，加速了胶凝相变的发生。而极短的成胶时间(~ 8 s)导致形成糟糕的水凝胶，不均匀的交联导致较弱的机械强度和较差的粘附性。稍微延长AG-PEG胶的成胶时间可有效促进胶的均一性。此外，我们改进了操作方式，通过连接器将两个填充AG和Tetra-PEG-SS溶液的注射器来回推三次，使预胶溶液快速混合，预胶溶液注射到出血创面后立即胶凝，无需外部催化(图1B)。

图2. AG-PEG胶的体外粘接与密封研究

AG-PEG胶的粘接与密封研究

AG-PEG的粘附强度决定了其至关重要的止血性能，因为在血液流动的情况下，胶水需要快速粘附才能止血。能够通过柔性网络耗散能量的粘合剂必须与组织形成牢固的粘结。由于AG-PEG胶水上的琥珀酰亚胺-活性酯部分与组织的氨基之间有很强的化学键合，因此AG-PEG胶水不能被水冲走，这表明它对组织有很强的粘附性。它可以在水下注射，用于潜在的止血应用于介入手术。采用抗压能力相关的爆破压力试验，评价胶粘剂能否形成牢固的密封性，以维持液体在动脉内的流动。图2A显示AG-PEG在湿猪腹主动脉上迅速形成并密封了直径为2 mm的穿透孔。15秒后，将主动脉以1 cm/min的流速泵入流动的PBS溶液中，持续保持密封直至破裂，破裂压力为~ 55 kPa (~ 376 mmHg)，显著高于人类正常的动脉收缩压(60 ~ 160 mmHg)和商用纤维蛋白胶(75±16 mmHg)(图2B)。抗压力性能优于文献报道的水凝胶。

图3. AG-PEG胶的生物相容性、凝血能力和生物降解性能

AG-PEG胶的生物相容性、凝血能力和生物降解性能

低细胞毒性和良好的血液相容性是应用水凝胶作为体内止血材料的重要先决条件。由于前体(PEG和明胶衍生物)具有固有的生物相容性本质，与NIH3T3细胞孵育5天后，研究者在CCK8细胞活力和活/死荧光测试中验证了出色的细胞相容性。一种有效的密封材料必须在最大限度减少血细胞损伤的同时诱导立即有效的血液凝固。为了评估AG-PEG胶的凝血能力，研究者通过添加到密封胶涂层的96孔板来确定全血的凝血时间(图3A)。在AG-PEG胶水或纤维蛋白胶水涂覆的孔中，血凝块分别耗时7.5 min和6.5 min，远快于未涂覆孔(对照)的12 min(图3B)。AG-PEG凝胶优异的凝血能力可能是由于AG上大量带正电荷的氨基成分与带负电荷的血细胞和蛋白质发生离子相互作用，从而形成絮凝物，加速凝血过程。此外，作为蛋白质分离纯化的常用聚合物，引入PEG衍生物的胶促进血液中的蛋白质絮凝，从而加速血液凝固。并对优化后的胶水配方进行血液相容性分析。如图3C-D所示。与RBC上清液孵育12 h后，AG-PEG胶的溶血率约为3.8%，低于医用材料国际标准的5%，表明AG-PEG胶具有理想的血液相容性。

图4. 大鼠肝损伤模型的止血与愈合

大鼠肝损伤的止血与愈合

通过大鼠出血性肝损伤模型初步研究了AG-PEG胶的体内止血能力。将手术刀切割的创面(长10 mm ×深3 mm)制成出血创面，AG-PEG胶注射后即可立即封闭出血创面，而纱布治疗组和纤维蛋白胶组均导致创面大量出血(图4A)，但纤维蛋白胶最终止血。记录肝脏止血过程中出血量和止血时间，定量评估活体止血能力。经纱布、纤维蛋白胶和AG-PEG胶处理后，出血可在6 min、100 s和20 s内停止，相应的出血量分别为400 mg、300 mg和50 mg(图4B-E)。与纱布治疗相比，使用AG-PEG胶的止血时间和出血量显著减少94%和87%(图4D-E)。更重要的是，与纱布辅助外压治疗不同，AG-PEG胶无需辅助即可自胶化，更适合治疗不可压性腔内出血。对纱布和胶粘处理后的肝损伤部位进行拍照和组织学观察，观察大鼠安乐死后的愈合时间。在术后第7天，纱布治疗组出现了严重的术后粘连(图4C)， 28天后，尽管部分组织再生，但仍可见微小的切口。相比之下，经过胶水处理的切口显示出快速愈合和再生，胶水在14天内继续降解和代谢，这与肝脏上Cy5.5 NHS酯标记的体内成像一致(图3F)。同时，切口变得可忽略不计，无炎症反应，有新生肝细胞存在。28 d后，肝创面再生良好，组织完整(图4F-G)。综上所述，AG-PEG胶优异的封闭性能归因于其止血及时、降解快，促进创面再生，使其能够起到粘连和物理屏障的作用，成为高效的止血封闭剂。

图5. 兔股动脉大出血、肝、心损伤模型的止血

家兔大出血的止血与封闭

研究者分别构建了雌性新西兰兔(2~3月龄，3.0~3.5 kg)的体内动脉、肝脏和心脏出血模型，以进一步证实AG-PEG胶在更有临床意义的情况下的体内疗效(图6A)。在外科手术中，通过动脉(0.8 mm Φ)、心脏穿刺(1.2 mm Φ)、左肝叶切肝(长30 mm ×深5 mm，左肝叶)，兔出现出血，尤其是从动脉和心脏创面喷出血液(图5B-D)。治疗组采用AG-PEG胶进行止血治疗，比较两组出血量和止血时间，并与商品纤维蛋白胶和纱布进行对照。注入AG-PEG胶后，在不借助止血钳的情况下，15 s内即可完全成功止血穿刺极部动脉，出血量约1 g(图5E)。相比之下，使用纤维蛋白胶直到止血钳夹住动脉才能止血，更严重的是，在取出止血钳后，血液继续渗出，导致严重失血超过10 g(图5E)。纤维蛋白胶可在350 s内止血，出血量超过2 g。采用AG-PEG胶处理切口时，出血量明显减少至0.7 g，止血时间缩短至~ 10 s(图5F)。值得注意的是，AG-PEG胶在穿刺创面注射20 s后能够迅速有效地阻止兔心脏的大量出血，出血量极少，约1.6 g，密封后没有进一步渗漏(图5G)。

图6. AG-PEG胶对猪股动脉大出血和肝损伤模型的止血作用

猪大出血的止血与封闭

在猪出血实验手术中(3月龄巴马猪，体重30~35 kg, n=3)，在猪股动脉中制造直径1.2 mm ×深度1~ 2 mm的损伤，诱导动脉血从穿刺处排出。注射AG-PEG胶前，用止血钳钳夹动脉。15秒后，让AG和PEG在动脉上有足够的相互作用，取出止血钳，从穿刺处没有看到进一步的出血(图6A-B)。而在应用纤维蛋白胶后，可以看到血液在松弛止血钳后立即流出。手术结果生动地证明了AG-PEG胶的快速止血能力。同样，AG-PEG胶对猪的出血性肝损伤也有快速止血的效果(图6C)。研究者在猪脾上创建了直径30 mm、深度5 mm的切口，猪脾通常是一个脆弱的内脏器官，切口有大量出血。应用AG-PEG胶后止血。对安乐死后的1头猪进行术后肝、脾组织分析。病理切片染色显示，胶水有效封闭了创面，创面界面几乎没有坏死，也很少出现炎症(图6D-E)，证明AG-PEG胶水具有良好的生物相容性和柔性黏附。此外，良好的血液相容性和黏附性刺激大量的红细胞和血小板黏附在胶水上，加速血液凝固(图6F-G)。

【小结】

在这项工作中，研究者报道了一种基于明胶和PEG的可注射的快速原位交联水凝胶作为急诊治疗的组织封闭剂，克服了传统封闭剂不能阻止大量组织出血的缺点。富含氨基的明胶增加了交联密度，形成了具有更高黏聚强度的AG-PEG，表现出更强的机械和黏附性能，同时保留了按需溶解的特性。冷水鱼皮明胶的良好流动性有助于更好的组织适用性，对出血创面形成强大的物理屏障。由于其较强的力学性能，可以通过简单的调整成分含量来控制凝胶时间，从而定制化满足不同出血组织的止血需求。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202208622

来源：BioMed科技