贻贝黏附蛋白型聚氨酯黏合材料的制备
成昭，张翊娟，程诗雅
（１．西安医学院 药学院，陕西 西安 ７１００２１
２．西安医学院 护理学院，陕西 西安 ７１００２１）
来源：弹性体 2022年2月 第32卷 第1期
基于生物来源黏合材料贻贝黏附蛋白的结构、进行材料结构设计，经 由 扩 链、偶 联 的 分 步合成，得到一种 ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料。以热失重分析、细胞毒性实验进行该黏合材料的初步性能评价，结果表明，该黏合材料聚合分布均匀、黏均相对分子质量为９５５，表现出良好的热稳定性以及对体外活细胞的低毒性，黏合材料质量浓度为４０００μｇ／Ｌ时、对 ＥＣＶ３０４细胞的２４ｈ增殖抑制作用低于３０％，具有进一步应用于生物医学领域、进行快速黏合修复的良好前景。
黏合材料；优化；热稳定性；毒性
人工合成材料的化学修饰与功能复合，是材料研发与应用领域的难点。人工材料的合成线路设计与合成条件优化可从两方面进行：一方面调控材料结构、简化合成步骤，增强人工合成材料结构的可修饰性；另一方面进行材料的功能性复合，同时，降低人工合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应，保证其生物亲合性能，这对于新型功能材料的研发工作意义重大。此外，相较于天然来源材料的复杂性与分离提纯难度，人工 合 成材料来源单纯，其结构与相对分子质量均处于一定的可调控范围，便于设计精准实验方案、系统考察合成材料的稳定性与毒性，建立仿生黏合材料在生命体 环 境 中 的 安 全 性 和 适 用 性 的 系 统 评 价参数。
１．１ 原料
二丁基二月桂酸锡（ＤＢＴＬ）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚丙二醇４００（ＰＰＧ４００）、异佛 尔 酮 二 异 氰 酸 酯 （ＩＰＤＩ）、二 羟 甲 基 丙 酸（ＤＭＰＡ）、Ｎ，Ｎ′－二环己基碳二亚胺（ＤＣＣ）、多巴胺盐酸盐、Ｎ，Ｎ′－二 甲 基 甲 酰 胺（ＤＭＦ）、三 乙 胺、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）：分析纯，阿拉丁试剂有限公司。上述市售试剂均经过除水等预处理，具体方法为：ＰＰＧ４００、ＤＭＰＡ 于１００℃下减压干燥３ｈ；ＤＭＦ以干燥剂无水硫酸钠进行初步无水处理，再经 ９０℃ 减 压 蒸 馏，加 入 ４Å 分 子 筛 （孔 径 为０．４ｎｍ），待用；三乙胺以干燥剂无水硫酸钠进行初步无水 处 理，再 经 常 压 蒸 馏，加 入 ４Å 分 子 筛（孔径为０．４ｎｍ），待用。
１．２ 仪器及设备
傅里叶变换红外分光光度计：ＴＥＮＳＯＲＴ－２７，德国 ＢＲＵＫＥＲ 公 司；超 导 核 磁 共 振 波 谱 仪：ＡＶＡＮＣＥ Ⅲ４００ＭＨｚ，德国 ＢＲＵＫＥＲ 公司；凝胶渗透色 谱 仪：ＰＬ－ＧＰＣ５０，美 国 ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ公 司；热 失 重 分 析 仪：ＰＥ－ＴＧＡ７，美 国 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公 司；多功能酶联免疫检测仪：１５１０ＭｗｌｔｉｓｋａｎＧｏ，美国 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司。
１．３ 合成制备
为了加强合成材料的化学修饰性，目标 ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料以扩链与偶联为主要合成步骤进行分段调控法合成，引入邻二酚黏合单元。首先，初步保证该合成材料的低毒性及生物相容性；其次，使人工黏合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰进一步成为可能。
目标聚氨酯黏合材料设计扩链、偶联 两 步 合成路径（见图１）：１）以ＩＰＤＩ与ＰＰＧ４００为初始原料，得 到 聚 氨 酯 预 聚 物（化 合 物 １），再 经 扩 链 剂ＤＭＰＡ、缩合剂 ＤＣＣ 与 催 化 剂 ＤＢＴＬ 共 同 作 用于扩链步骤，得到聚氨酯预聚物扩链产物（化合物２）；２）为了进一步改善目标材料的聚合性能及相对分子质量分布，在平均相对分子质量较小的扩链产物结构基础上，通过功能修饰调控与邻二酚黏合单元接 入，合 成 得 到 目 标 ＭＡＰ 型 聚 氨 酯 黏合材料（化合物３）
（１）化合物１：聚氨酯预聚物的合成将ＩＰＤＩ、ＰＰＧ４００（物质的量比为２:１．２）与适量溶剂 ＤＭＦ混 合 均 匀，氮 气 保 护 反 应６ｈ，经减压蒸馏，得到无色至浅黄色油状物的聚氨酯预聚物，即 ＰＰＧ４００－ＩＰＤＩ（化合物１）。
（２）化合物２：聚氨酯预聚物扩链产物的合成作为高分子材料扩链与枝节化的关键步骤，扩链剂 ＤＭＰＡ 与催化剂 ＤＢＴＬ的反应投入量对聚氨酯预聚物扩链合成步骤具有重要意义。为了筛选 最 优 条 件，调 控 化 合 物 １、ＤＭＰＡ 与 ＤＢＴＬ物质的量比分别为１:１:０．２、１:２:０．２、１:２:０，合成得到三种不同投料比的预聚物扩链产物 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３。经后续的偶联反应得到三种终产 物，即分别以 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３衍生修饰的黏合材料。进行三种黏合材料的红外光谱与核磁共振氢谱测定，结合光谱结果，分析以 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３衍生修 饰 的 三 种黏合材料的枝节率水平与扩链程度，考察 ＤＭＰＡ与 ＤＢＴＬ 两 种 关 键 反 应 物 对 预 聚 物 扩 链 反 应 的影 响，进 而 确 定 最 优 反 应 投 料 比 为 化 合 物 １、ＤＭＰＡ 与 ＤＢＴＬ物质的量比为１:２:０．２。根据上述反应物投料比筛选的最优条件，将步骤（１）得到 的 化 合 物１、ＤＭＰＡ、ＤＢＴＬ（物 质 的量比为１:２:０．２）与适量溶剂 ＤＭＦ 混合均 匀，氮气保护反应３ｈ，得到无色至浅黄色油状物的聚氨酯预聚物扩链产物，即化合物２。（３）化 合 物 ３：ＭＡＰ 型 聚 氨 酯 黏 合 材 料 的合成将步骤（２）得 到 的 化 合 物２、ＤＣＣ、多 巴 胺 盐酸盐、三乙胺（物质的量比为１:０．１２:１:０．１）与适量溶剂 ＤＭＦ混 合 均 匀，氮 气 保 护 反 应８ｈ，得到粗产物沉淀，进行粗产物沉淀酸洗、透析，得到浅黄色油状 物 的 ＭＡＰ 型 聚 氨 酯 黏 合 材 料，即 化合物３。
２．１ ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料的结构表征
２．１．１ 红外光谱对材料枝节率水平的反映
将以 Ｐ１、Ｐ２衍生修饰的两种黏合材料分别进行 ＫＢｒ压片与红外光谱测定，得到其红外吸收光谱，如图２所示。其中，３４７５ｃｍ－１处酚羟基与１６４５ｃｍ－１处酰胺键的特征吸收峰说明聚氨酯材料侧链已成功接入了邻二酚黏合单元。
同时，红外光谱出峰强度也具有定量意义，能在一定程度上反映黏合材料聚氨酯侧链中黏合单元多巴胺的引入量以及材料枝节率水 平。Ｐ１与Ｐ２分 别 由 化 合 物 １、ＤＭＰＡ、ＤＢＴＬ 物 质 的 量 比１:１:０．２与１:２:０．２得 到，再 经 偶 联 修 饰 后，得到以 Ｐ１、Ｐ２衍生修饰的两种黏合材料，对比两种黏合材料红外光谱特征峰的出峰强度，可知扩链剂 ＤＭＰＡ 的用量加倍时，材料枝节率水平得到明显提高。
２．１．２ 核 磁 共 振 氢 谱 对 催 化 剂 影 响 扩 链 反 应 的判断
合成聚氨酯预聚物扩链产物（化合物２）的扩链步骤中，为了确定催化剂 ＤＢＴＬ对目标聚氨酯黏合材料扩链程度的影响，设计催化剂加入与未加入两条合成路径，分别得到 Ｐ２与 Ｐ３两种聚氨酯预 聚 物 扩 链 产 物，经由后续偶联反应，得 到 以Ｐ２、Ｐ３衍生修饰的两种黏合材料，将其分 别 标 注为（ＰＰＧ４００－ＩＰＤＩ）－ＤＭＰＡ＋ＤＢＴＬ（Ｐ２）、ＰＰＧ４００－ＩＰＤＩ）－ＤＭＰＡ（Ｐ３）。测定上述两种黏合材料１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＴＭＳ），得 到 如 图３所 示的核磁共振氢谱，特征氢的化学位移（δ）见图３中的归属及标注。
图３中，δ＝７．８２与３．６０分别对应于羧基与酚羟基中活泼氢的特征位移，说明聚氨酯预聚物扩链产物与多巴胺盐酸盐的反应已在聚氨酯材料侧链成功接 入 邻 二 酚 黏 合 单 元。此 外，对 比 图３（ａ）与（ｂ）两个系列的谱线，即以 Ｐ２及 Ｐ３衍生修饰的两种黏合材料，在保持两组谱线１ＨＮＭＲ 测样量一致时，扩链反应中加入催化剂 ＤＢＴＬ、再经后续偶联反应，得到的（ＰＰＧ４００－ＩＰＤＩ）－ＤＭＰＡ＋ＤＢＴＬ（Ｐ２），其特征氢的谱线强度均有显著增强。经１ＨＮＭＲ测试，证明催化剂 ＤＢＴＬ能显著提高目标 ＭＡＰ型聚 氨 酯 黏 合 材 料 的 枝 节 率，从 而 进一步影响材料性能。
综合红外与核磁谱图分析结果可以看出，相较于 Ｐ１、Ｐ３，以最优反应投料比得到的聚氨酯预聚物扩链产物 Ｐ２为 基 础 合 成 的 ＭＡＰ 型 聚 氨 酯黏合材料，表现较高枝节率与扩链程度，因此对该黏合材料进行进一步的相对分子质量分布测定、热稳定性与安全性分析。
２．１．３ 凝胶渗透色谱对材料相对分子质量分布的反映
以 ＤＭＦ为 流 动 相，聚 苯 乙 烯 为 标 准 聚 合 物（温度为４０℃，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ），合成得到的ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料经凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）测定，得到聚合材料的相对分子质量分布，如图４和表１所示。
由表１中的 Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２１３２可知，多分散指数接近于１，表 明 所 合 成 的 高 分 子 聚 氨 酯 黏 合材料聚合分布均匀，其 Ｍｖ 为９５５。
２．２ ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料的热稳定性与安全性评价
２．２．１ 热稳定性
４０～８００℃温度范围内，进行所合成 ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料的热失重分析（氮气环境，升温速率为２０℃／ｍｉｎ，样品用量为５ｍｇ），得 到 其 热 重分析曲线，如图５所示。
由图５可知，合成的聚氨酯黏合材料表现良好的热稳定性，热失重趋势平滑、曲线连续，与弹性体的 热 稳 定 性 具 有 相 似 之 处。
聚 氨 酯 合成材料具有两个热失重阶段，分别为１５０～２５０℃软段热失重与２５０～３２０℃硬段热失重，其中，软段失重因ＩＰＤＩ和 ＤＭＰＡ 分解 而 产 生，硬 段 失 重因 ＰＰＧ４００分解而产生。
２．２．２ 细胞毒性
以四氮唑蓝比色法（ＭＴＴ）评价所合成 ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料的细胞毒性，得到聚氨酯合成材料对体外活 细 胞 的 增 殖 抑 制 作 用 曲 线，如 图６所示。在温度 为３７℃、ＣＯ２ 含 量 为５％（体 积 分数）、湿度为９０％的条件下，将所合成聚氨酯黏合材料的 ＤＭＦ溶液加入培养２４ｈ的人脐静脉内皮细胞（ＥＶＣ３０４）中，进 行 目 标 材 料 的 质 量 浓 度 梯度分组，使各组聚氨酯黏合材料的最终质量浓度分别为１２５、２５０、５００、１０００、２０００、４０００μｇ／Ｌ，每组质量浓度设６个平行孔，对照组加入等体积溶剂。加样后，于上述条件下继续培养２４ｈ，每孔加入２０μＬ 四 氮 唑 蓝 溶 液 和 １８０μＬ 培 养 液，培 养４ｈ。移去上清 液，每 孔 再 加 入 ＤＭＳＯ１５０μＬ，充分震荡后测定４９０ｎｍ 处吸光度，计算 ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料对 ＥＶＣ３０４细胞的２４ｈ增 殖抑制率：细胞增殖抑制率＝（１－吸光度实 验 组／吸光度对 照 组 ）×１００％，得到细胞增殖抑制曲线，如图６所示。
由图６可以看出，ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料对ＥＶＣ３０４细 胞 表 现 低 毒 性。聚 氨 酯 合 成 材 料 在ＥＣＶ３０４细胞中的增殖抑制作用随自身浓度增加而增大，就其浓度增幅的整体趋势而言，聚氨酯合成材料呈现低毒性。
（１）基于 ＭＡＰ结构中邻二酚功能片段的 黏合机制，进行聚氨酯材料的功能化修饰，合成得到ＭＡＰ型聚氨酯黏合材料。
（２）合成 得 到 的 ＭＡＰ型 聚 氨 酯 黏 合 材 料 聚合分布均匀，多分散指数接近于１，Ｍｖ为９５５，热失重曲线连续，热稳定性良好，温度高于１５０℃时出现热失重。
（３）所合 成 的 ＭＡＰ 型 聚 氨 酯 黏 合 材 料 对 体外活细胞表现低毒性，黏合材料质量浓度为４０００μｇ／Ｌ时，其对 ＥＣＶ３０４细 胞 的２４ｈ增 殖 抑 制 作用低于３０％，具有进一步应用于生物医学领域的良好前景。
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