本文旨在利用静电吸附作用将CHI/CMC复合药物涂层制备到聚氨酯（Polyurethane，PU）敷料上，组装示意图如图1所示。通过化学交联改变自组装涂层的内部结构，增加其稳定性从而将抗菌中药小分子苦参碱（Matrine，MAT）结合到涂层上，并提升聚氨酯敷料的机械性能。该载药交联涂层能抑制大肠杆菌 （E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生长，结合壳聚糖潜在的抗菌性能，对细菌的抑制作用进一步增强。这种稳定的交联涂层为植入体、医疗器械和医学设备表面改性涂层的开发及应用扩展提供了新的方法和思路，基于抗菌性壳聚糖/羧甲基纤维素复合药物涂层的聚氨酯敷料有望作为创面敷料应用于临床。

1. 1　仪器和试剂

    Regulus 8100 型扫描电子显微镜（SEM，日本 Hitachi 公司）；Spectrum Two DTGS 型傅里叶变换红外 光谱仪（FT-IR，英国 PerkinElmer 公司）DR6000 型紫外可见分光光度计（UV-Vis，美国 HACH 公司）；SDC-100 型接触角测角仪（东莞 SINDIN 晟鼎精密有限公司）；Proline 型电子万能试验机（德国 Zwick 公 司）；Multiskan Sky型酶标仪（美国Thermo公司）；pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。壳聚糖（5×104~3×105，取代度75%~85%）、羧甲基纤维素（相对分子质量为25 kDa）均购自美国Sigma公司；苦参碱（≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司；2-吗啉乙磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid，MES，≥99%）、50%戊二醛购自上海Adamas公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Gibco公司；LB肉汤、琼脂 粉购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；大肠杆菌（CMCC44102）购自北京索莱宝科技有限公司；金黄色葡萄球菌（ATCC43300）购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司；聚氨酯敷料基底购自于青岛海氏 海诺集团有限公司；聚（对苯二甲酸乙二醇酯-1，4-环己二烯二亚甲基对苯二甲酸酯）（Poly（ethylene terephthalateco-1，4-cylclohexylen-edimethylene terephthalate，PETG）板购自昆山科瑞试验仪器有限公司；1-乙基（- 3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（3（- 3-Dimethylaminopropyl）-1-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）均购自国药集团化学试剂有限公司。

1. 2　自组装涂层的制备

    首先，将硅片、载玻片和聚氨酯敷料基底在无水乙醇中浸泡清洗，去离子水冲洗后用氮吹仪吹干备用。用等离子体处理洁净的基底，使其表面带负电荷。1 mg/mL的CHI在体积分数为2%的乙酸溶液中溶解，1 mg/mL的CMC在去离子水中溶解，搅拌过夜，形成均一溶液。将上述聚电解质溶液的pH值均调整为4。使用CHI作为带正电荷的聚合物，CMC作为带负电荷的聚合物，利用LBL自组装技术在基底上制备CHI/CMC涂层。将基底浸入CHI溶液中10 min，取出后用去离子水洗涤3次，以去除基底表面未牢固吸附的CHI分子。然后，再将基底浸泡在CMC溶液中10 min，去离子水漂洗。重复以上操作n次，得到了不同层数的（CHI/CMC）n涂层（n=双层膜的数量）。最后，用N2干燥保存备用。

1. 3　自组装涂层的化学交联

    使用 EDC/NHS/MES 交联剂作为涂层化学交联的第 1 步。将带有 CHI/CMC 涂层的基底浸在含有0. 2 mol/L EDC和5 mmol/L NHS的0. 05 mol/L的MES溶液中20 min，在1×PBS缓冲液中浸泡10 min。利用2. 5%戊二醛溶液作为第2交联剂，涂层与其额外交联处理40 min。交联完成后用去离子水冲洗3次。

1. 4　自组装涂层的表征测试

    采用UV-Vis观测载玻片基底层层自组装过程中涂层的厚度变化，波长扫描范围为190~900 nm，扫速为2 nm。采用SEM观察不同基底涂层及化学交联涂层的表面形貌。测试之前，喷金处理2 min，放大 倍数为 1×104倍。采用 FT-IR研究了聚合物和涂层的官能团特征，扫描范围为 700~4000 cm-1，扫描次数 为 32 次。为了评估薄膜的亲水性，利用接触角测角仪测量了化学交联前后涂层的静态接触角。使用 座滴法分别测量样品的左接触角和右接触角，取其平均值，测试时滴加的液滴体积为 5 μL。参考国标GB/T1040-2006，使用电子万能试验机测试纯 PETG板和交联 PETG-（CHI/CMC）10的力学性能，在室温下 以预载5 N，拉伸速度1. 5 mm/min进行测试，拉伸至断裂。

1. 5　涂层的药物载释行为

    将硅片基底交联（CHI/CMC）25涂层、空白聚氨酯敷料和聚氨酯基底交联（CHI/CMC）10涂层在1 mg/mL的苦参碱溶液中浸泡 1 h，用去离子水将表面残留的苦参碱去除。然后置于 10 mL 的 1×PBS 缓冲液 （pH=7. 4， 37 ℃）中，于 37 ℃的环境下进行药物释放，间隔一段时间，定时吸取 1 mL的释药溶液储存到 离心管中，然后补足等量的1×PBS缓冲液。利用紫外可见分光光度计在210 nm处测定离心管中释药溶液的吸光度，根据苦参碱的药物浓度-吸光度标准曲线计算出单位面积载药涂层的累积释药量。

1. 6　涂层的抑菌性能测试

    分别选取革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为实验对象，采用细菌悬液法 测试涂层的抑菌率。细菌复苏活化，待其生长到指数期时，将菌液稀释约至 1×105 CFU/mL 的浓度。将带有涂层和载药涂层的硅片样品正反两面均放在紫外灯下照射灭菌 30 min备用。96孔板每孔中加入100 μL的菌液和等体积的LB肉汤，设置阴性对照组（仅加入200μL的LB肉汤）和阳性对照组（仅加入100μL菌液和100 μL的LB肉汤）。然后，将灭菌的带有涂层的硅片样品、带有载药涂层的硅片样品 和等量游离苦参碱添加到96孔板中，放于37 ℃培养箱中静置培养。24 h后用酶标仪测定OD600，按照公式（1）计算细菌抑菌率（Bacterial inhibition rate，BIR）。

式中，ODs为样品组的吸光度值，ODp为阳性对照组的吸光度值，ODn为阴性对照组的吸光度值。

2. 1　涂层的构建及表征

2. 1. 1　复合涂层的厚度表征

    在本研究中，使用层层自组装技术制备了（CHI/CMC）25涂层。CHI和CMC在不同pH值下的电离度 不同，调整 pH值为 4更有利于 CHI和 CMC的电离。CHI的—NH2基团结合质子后形成 NH+ 3而带正电 荷，CMC的—COOH基团电离成—COO而带负电荷。在负电荷修饰基底表面的情况下，LBL自组装开始 于通过静电作用沉积1个带正电荷的CHI层，然后是1个负电荷的CMC层。为了直观反映多层膜的成功 沉积，使用UV-Vis测量涂层的吸光度。涂层在 300 nm附近处的紫外吸收峰值越大，则涂层越厚。图 2的增长曲线显示涂层的紫外吸收随着自组装层数的增加而增加，增厚曲线无明显的不规则性，表明了LBL自组装涂层的逐层成功沉积。

2. 1. 2　复合涂层的FT-IR表征

    从图 3 的 FT-IR 光谱中可以看出，CHI 和 CMC的光谱清晰地反映了这2种高分子材料相应的特征峰。CHI的红外光谱图中，3500 cm-1是O—H和N—H的伸缩振动吸收峰，1346 和 1152 cm-1处为 C—N 的 伸缩振动峰。在CMC的红外光谱图中，2926 cm-1处 是C—H的伸缩振动，1598 cm-1附近是C—O伸缩振动峰。另外，（CHI/CMC）25涂层在3400 cm−1附近有2个明显的峰，主要是由于O—H 和 N—H 信号峰重叠，在 1640 cm-1主要是O==C—O 峰，这些结果表明了多层膜的成功组装。化学交联涂层的FT-IR光谱观察到2个明显的分离峰，分别在1680 cm-（1 O==C） 和1645 cm-（1 N—H）处对应酰胺键，显示成功交联。

2. 1. 3　复合涂层的SEM表面形貌

    性质不同的天然高分子材料层层自组装形成不同结构的涂层，涂层的表面也呈现出有区别的形貌。图4的SEM图像显示，（CHI/CMC）25涂层是具有小孔隙的致密粗糙结构（图4A），化学交联改变了自组装涂层的表面形貌，涂层经交联膨胀后，从而确保了孔隙可以形成的区域。交联后的（CHI/CMC）25涂层表面的孔隙度更高，最外层表面局部扩张断裂，从而出现细小缝隙，涂层转变为疏松的粗糙结构（图4B）。在不同基底上制备的功能性涂层具有不同的表征和性能。聚电解质在聚氨酯泡沫上堆积成膜（图4C）， 聚氨酯基底上的交联涂层更具颗粒感（图4D），表面不平整。表面形貌的改变是主要是由于分子间交 联形成的酰胺键、内部分子结构变化和涂层内空间结构改变的结果。

2. 1. 4　复合涂层的接触角

    液体在固体涂层表面上的水接触角（Water contact angle， WCA），是衡量表面润湿性能的重要参数。若接触角小于 90（°），代表是亲水性表面，液体较易润湿涂层表面。接触角越小，表示润湿性越好。表面粗糙度的改变会影响涂层表面的亲水性。根据图 5的接触角测量结果，经过化学交联，（CHI/ CMC）25涂层的静态接触角由 43（°）降低为 3（°），形成超亲水状态，可形成水合层，抵御微生物的聚集粘附。涂层中CHI和CMC具有亲水性官能团—NH2和—COOH，在对亲水表面进行化学交联时，形成新的酰胺键使得涂层的亲水性增强。同时，影响亲水性的另一个重要因素是粗糙度，化学交联形成更为粗 糙的涂层表面结构，在粗糙的表面下，交联涂层的浸润性更强。 

2. 1. 5　复合涂层的机械性能

    通常，涂层的机械性能取决于成膜材料的相对分子质量和含量，以及它们之间的相互作用。高分子聚合物制备的涂层具有较好的强度、刚度和柔韧性。抗拉强度和断后延伸率是反映涂层力学性能的两个重要特性。PETG板和交联PETG（- CHI/CMC）10的力学性能如表1所示。测试结果表明，与单纯PETG板 基底相比，在PETG板上制备交联（CHI/CMC）10涂层后，涂层的断裂时间、标准应变、断后延伸率、最大失效载荷和抗拉强度均有不同程度的增加。交联PETG（- CHI/CMC）10的断裂时间由纯PETG板的87. 3 min增加到109. 2 min，标准应变从130. 9 mm增加到163. 7 mm，抗拉强度也从45. 8 MPa升高到48. 1 MPa。与 纯PETG底板相比，交联PETG-（CHI/CMC）10涂层的断裂时间、标准应变和抗拉强度分别提升了25. 1%、25. 1%和5. 0%，表明CHI/CMC涂层的存在可以显著改善基底的力学性能。

2. 2　涂层和涂层修饰聚氨酯敷料的药物释放性能

    采用扩散加载的方式，将苦参碱载入不同基底的交联涂层中，测定其药物释放量。化学交联大幅提升涂层在载入碱性药物时的稳定性，药物载释过程中涂层不会发生崩解或溶蚀现象。图6是在生理条件下的药物释放谱图，硅片基底交联（CHI/CMC）25涂层的载药量为27. 8 μg/cm2，空白聚氨酯基底的载药量为 285. 2 μg/cm2，聚氨酯基底交联（CHI/CMC）10涂层的载药量为 330. 0 μg/cm2。化学交联不仅提高了涂层的稳定性，还扩大了涂层的孔隙，交联后的涂层结构更有利于药物小分子的进入，药物可以加载到更深的内部。相较于空白聚氨酯基底，聚氨酯基底（CHI/CMC）10交联涂层的载药量提升了20%，即增加 了44. 8 μg/cm2，该增加量高于硅片基底（CHI/CMC）25交联涂层的载药量，表明在聚氨酯基底上修饰交联涂层能够提升其载药量。与硅片基底（CHI/CMC）25交联涂层相比，聚氨酯基底（CHI/CMC）10交联涂层的载药量提升了10. 9倍，聚氨酯基底表面存在大量的原始孔洞，具有很强的药物装载能力，使得载药量大幅提升。同时，硅片基底（CHI/CMC）25涂层的释药百分比在0. 5 h后就趋近于100%，空白聚氨酯和聚氨酯基底（CHI/CMC）10交联涂层的药物释放量在1 h时才达到90%左右，表明聚氨酯基底可减缓药物的释放速度，可能是由聚氨酯基底表面的多孔膜结构增加了药物从聚氨酯内部向外扩散的阻力而造成。 

2. 3　自组装涂层的抑菌性能

    为了评估涂层的抑菌性能，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为代表性菌。涂层对大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌的抑菌率如图7所示。结果表明，实 验组的涂层和载药涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌均有一定的抑制作用。（CHI/CMC）25涂层与苦 参碱单药的抑菌率大致相同，苦参碱是通过抑制细 菌早期生物被膜生成而产生抑菌作用。壳聚糖 则是通过质子化的氨基与细菌表面带负电的物质产生相互作用，从而破坏细菌的细胞壁抑制其生长，并且壳聚糖对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细 胞壁的破坏方式不同，导致（CHI/CMC）25涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率有所差别。等量苦参碱组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为 22. 2% 和 17. 1%，载药（CHI/CMC）25涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为53. 8% 和 35. 7%，与单药组相比，复合药物涂层的抑菌效果增强了 1倍。与涂层、等量的游离苦参碱组对比，载药涂层对细菌具有更强的抑菌作用，体现出了壳聚糖和苦参碱的共同抑菌效果。